病理制片技术手册

第一章 病理标本的接收

第二章 组织固定

第三章 取材

第四章 组织脱水

第五章 包埋

第六章 组织石蜡切片

第七章 常规染色

第八章 封片

第九章 冷冻切片的制作

第十章 常用特殊染色

第十一章 常用试剂及染液的配制

第一章 病理标本的接收

病理标本的接收是在取材、固定组织前首先要做的第一步工作，它是临床与病理科交接的一个重要环节，它为开展病理学检查、病理档案的保存奠定了基础。

标本接收程序如下。

• 1．首先核对病理申请单与标本上的红色号码是否一致。

  2．核查病理申请单上写明的送检标本及数目是否与实际送检标本一致。

  3．观察送检标本的大小及固定液比例是否合适。

  (1)穿刺活检及纤支镜所取的小标本，4％中性甲醛(10％中性福尔马林)固定组织的量应在6～10倍。

  (2)对于较大的手术切除标本，应及时切开固定；核对后将病理申请单和标本编上病理标本号。

  4．将病人姓名、性别、年龄、病历号、科别、临床诊断、部位、标本来源、标本例数等逐项录入电脑存储。

  5．作为病理资料不仅要做好计算机录入工作，还须进行文字登记，以便病理档案长期保存。

  第二章 组织固定

  一、固定的目的和意义

  活体组织一旦停止血液循环和物质代谢就会因物质代谢障碍产生一系列的生物化学和组织化学改变，并导致形态学上可见的细胞器变化和细胞组织的形态改变直至腐败自溶。固定的目的就是要通过使用化学和物理的方法，尽可能地保存组织细胞离体时具有的生理和病理形态结构及生物化学和免疫化学成分。

  良好的固定是制作优秀病理切片的基础，也是特殊染色、组织化学、免疫组织化学和组织原位分子杂交等技术方法赖以成功的基础。

  因此，在病理技术工作中必须高度重视固定的质量。

  二、组织固定的注意事项

  1．及时取材：由于甲醛对组织的平均穿透速度只有0.8 mm/h，因此手术切除的送检标本应及时切开进行取材，以便保证重要的镜检部位能及时地得到固定。

  2．及时固定：完成取材的组织块应立即投入固定液以便尽可能地保存组织细胞的形态结构和抗原性。

  3．液量充分：一般情况下要求固定液的量应为组织体积的6～10倍。

  4．适度固定：现代固定的要求是，在良好保存组织细胞形态结构的同时尽可能较好地保存组织细胞的抗原性。长时间的固定会导致某些组织抗原性的逐渐丧失，因此，适时固定可以在保存细胞结构和抗原性之间取得必要的平衡。对于较大的送检标本而言，在及时切开固定的基础上，应尽可能在24 h以内取材进入组织脱水程序。

  5．适宜温度：低温可以降低固定的速度，反之可以加快固定进程。在自动组织脱水机上可以施加恒定的温度使得在有限的时间内可以完成固定过程。一般情况下应将固定温度控制在36~38℃。

  6．适当搅拌：在自动组织脱水机上可以通过使用搅拌和试剂循环功能使固定过程在标本与试剂充分接触的条件下完成。

  三、固定液的选择

  影响标本固定的因素很多，如组织与固定液的比例、固定时间、固定温度等；除此之外，固定液本身也很重要，若所选固定液不当，细胞内蛋白质、脂类、核酸等成分将会有不同程度地损失。固定剂最好随配随用，并注意其浓度和酸碱度。因此根据实际工作的目的，选用合适的固定液非常重要。下面是一些常用固定液的配制方法及适用范围。

  1．单纯固定液

  (1)4％中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。一般无特殊要求的病理标本均适用。尤其值得注意的是，中性甲醛是以pH 7．2～7．4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4％甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。

• 甲醛(40%) 100 ml

  无水磷酸氢二钠6.5 g

  磷酸二氢钠4.0g

  蒸馏水900 ml

  (2)乙醇固定液：使用时以80％～95％的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，如果用于证明尿酸结晶和保存糖原，可用100%乙醇固定组织。

  (3)4％的多聚甲醛：主要用于培养细胞的固定。

  2．混合固定液

  (1)乙醇一甲醛(乙醇－福尔马林，AF)固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95％乙醇脱水。

  甲醛(40％) 100 ml

  95％乙醇 900 ml

  (2)B5(醋酸钠一升汞一甲醛)固定液：多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。

• 无水醋酸钠1.25 g

  升汞6.0 g

  蒸馏水90 ml

  使用前加入甲醛10 ml

  (3)Bouin固定液：特别适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。需现配现用。

• 饱和苦味酸水溶液(约1.22%) 75 ml

  甲醛25 ml

  冰醋酸5 ml

  (4)Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，特别适合于固定外膜致密的组织，亦适用于糖原及尼氏小体的固定。

• 无水乙醇60 ml

  氯仿30 ml

  冰醋酸10 ml

  (5)Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清晰，但成本较昂贵且需特殊处理汞。该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。

• 升汞5.0 g

  重铬酸钾2.5 g

  硫酸钠1.0g

  蒸馏水(加至) 100 ml

  四、操作方法

  临床医师切取标本后，应尽快将标本置于盛有足够量固定液的容器内，尽量避免可能出现固定不及时或不充分导致标本干涸或腐败，无法进行切片制作。病理科工作人员验收标本后，必须对临床初步固定的标本及时进行规范的处理：对于穿刺及胃肠镜所取的小标本，直接添加中性甲醛，添加的量应6～10倍于标本体积；对于较大的手术切除标本应呈书页状切开、有包膜的标本切开固定，切开的厚度1 cm左右，为了保存标本的原有大体形态，切开时最好不要完全断开，两切面之间用脱脂棉或纱布隔开，然后放人6～10倍体积的固定液中完全淹没。特殊标本特殊处理：如脾脏或淋巴结等包膜较厚，固定剂渗透力有限，应切薄薄的一小片单独固定，对于宫颈锥切标本及胃肠等空腔器官应及时钉板展开固定。固定到取材的时间应视标本的大小及切面的厚度而定，小标本应不少于4 h,大标本不少于18 h。

  第三章取材

  一、概念

  取材是将送检标本进行客观描述并将病变部位组织切成厚薄适度的小片后装入小盒(进入组织脱水程序)，取材至关重要。

  二、取材环境

  取材室由取材台、记录桌、标本陈列架、电脑查询等组成；取材台应有良好的排风、进出水系统，配备齐全的刀、剪、镊、尺等基本工具和备用固定剂，记录桌应备有打号机(无时应用铅笔)、记录纸张、标本小盒及盒盖等，标本陈列架应存放、拿取方便、排风良好，电脑查询应与登记台和医师诊断记录结果的计算机相连。

  三、操作

  1．首先进行核对：记录者拿出一份申请并唱出病理号，取材医师按病理号拿出一份标本，核对无误后唱出申请单编号，记录者核对无误后念出申请单上填写的取材部位和送检标本份数及具体块数，取材医师核对无误后对标本进行具体描述。

  2．对送检标本的观察和描述：可分为活检小标本(包括经内窥镜获取的黏膜组织、浅表或深在部位的穿刺物、子宫腔刮取物、经微创手术由器官或肿瘤中切取的不完整组织等)和手术大标本。

  (1)小标本检查：描述送检标本的数量(量少时精确计数)、大小(量少时精确测量，量多时聚堆测量体积)、色泽、形状以及质地等。

  (2)大标本检查：①检查切除标本的手术类型。②测量标本的大小；描述标本的形状、色泽、有无包膜或被膜及质地，必要时(如内分泌肿瘤)要在切开标本前称重；带有脏器的标本还应注意检查病变与有关脏器的比邻关系。③按操作规范切开检查标本切面，如实性区域观察色泽、质地、纹理、有无出血坏死以及肿瘤肉眼浸润深度和范围；囊性区域观察囊肿壁的厚度、内外表面、内容物及其性状等。④注意各系统脏器大体检查的特殊要求。⑤必要时绘制简图说明标本大体特点和解剖关系，也可进行表面及剖面摄影，以保存大体资料。

  3．组织取材：按病理诊断和研究的目的和要求，从标本上切取适当大小和数目的组织块，供后续制片和显微镜下观察用于诊断以及相关研究。取材的一般原则如下。

  (1)认真地进行大体检查，准确选取病变部位。

  (2)显示病变全貌，切取有代表性的病变区域组织，包括病变周边相对正常的组织和坏死组织等；对有肿瘤的标本应包括切缘、肿瘤包膜及转移部位等。

  (3)组织块的面积通常为2.0 cmX1.5cm，厚度不超过3.0mm。太大太厚的组织块常会固定不充分，而影响脱水和制片。组织块的数量依具体情况而定，一般以满足诊断和相关研究需要为准。

  (4)骨或钙化组织需要先经脱钙处理；腔道器官及囊壁组织应立埋。

  4．记录：大体检查和取材要由具备一定经验的病理医师进行，应配备人员进行记录。记录人员负责如下事宜。

  (1)每例标本在病理医师进行大体检查和取材前，与其共同核对该例标本份数、内容、病变特征及其标志是否与申请单相关内容一致。

  (2)病理医师在进行大体检查和取材时，记录人员根据申请单向医师报告病人基本情况、术中所见、送检医师特殊要求等，并如实清楚地将病理医师口头描述记录于记录单上，必要时绘制简图显示大体所见及标示取材部位。

  (3)病理医师取材完毕后，与其共同核实取材内容，确保组织块及其编号标签准确置人脱水盒内，并在记录单和取材工作单上签名并签署日期。

  5．注意事项

  (1)核对要认真，描述要客观，取材要准确。

  (2)每例标本取材前后，均应用流水彻底清洗取材台面和所有相关器物，避免交叉污染。

  (3)细小标本取材时可用伊红点染并用滤纸包裹，严防标本丢失。

  (4)大标本取材大小要适当(组织块的面积通常为2.0cm×1.5cm，厚度不超过3.0mm)

  (5)取材刀刃要锋利，避免使用钝刀或齿镊过度挤压组织，取材动作要轻柔，不可来回切割或过度牵拉组织，以免组织结构变形或内部细胞脱落。

  (6)组织块切面应平整，如有线结和钢丝应拔除。

  (7)所取组织应包括各脏器的重要结构或全层。

  (8)特殊标本要在取材前照相留资料。

  第四章组织脱水

  组织经固定后会有大量水分，组织脱水是用某些溶剂逐渐将组织内的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡的渗入。

  一、手工脱水

  1．器械准备：大标本缸6个，浸蜡用金属缸3个，脱水篮，恒温烤箱。

  2．日常工作程序见表5．1。

3．注意事项

• (1)所用标本缸要大一些，达到组织块与液体比6～10倍。

  (2)固定液、脱水剂要勤更换，可以采用前移更换。

  (3)二甲苯时间不宜过长，不要超过2 h。

  (4)石蜡温度不得高于60℃。

  (5)所有程序应每间隔0．5 h摇动2～3次以利于固定脱水浸蜡彻底。

  二、半自动脱水机

  半自动脱水机日常工作程序可参考全手工脱水日常工作程序进行。梯度乙醇的脱水时间加长。注意事项同手工脱水。

  三、全自动密闭式脱水机

  全自动密闭式脱水机有控制面板、处理槽、石蜡箱和试剂柜四个部分。为保证组织处理无刺激味道，全自动密闭式脱水机还设有活性炭过滤器。

• (1)控制面板有显示屏和小键盘，可由此输入20个不同的处理程序，可设置处理时间和温度，可启动P/V循环(压力和真空交替)和混合循环，出现故障时有报警提示。

  (2)处理槽是组织块进行处理的容器。

  (3)石蜡箱可将熔化的石蜡保持在设定的温度待用。

  (4)试剂柜装有处理试剂。

  1．日常工作程序见表5．2。

注：截止时间为1/8：00 am

2．双休日工作程序：脱水程序及各试剂的所用时间及功能相同，只将截止时间调至3/8:00 am即可。

3．外检小标本工作程序见表5．3。

注：截止时间为1／8：00am

4．小动物组织工作程序见表5．4。

5．大动物组织(如狗、兔、猴)：可以同外检组织使用一个程序。

6．脱水程序运行完毕后处理。

• (1)先按泵出按钮将石蜡抽回缸内，再打开处理槽将组织块取出。

  (2)将处理槽内及槽盖上的余蜡擦净。

  (3)将底部中央过滤器螺丝拧开，将管道口的蜡擦净，拧紧螺丝。

  (4)盖上盖后，按清洗按钮清洗。

  7．全自动密闭式脱水机的注意事项。

  (1)固定液每三天更换一次，组织块为600～800块。组织固定的好坏直接影响切片质量。为达到组织固定彻底的目的，可使用脱水机的P／V循环和混合循环功能，也可将温度定在38～40℃。

  (2)梯度乙醇脱水剂每星期更换一次，组织块约为1000～1200块。方法是将第二缸的80％乙醇倒弃，以后的95％乙醇和无水乙醇依次前移。只将最后一缸的无水乙醇更换为新液。这样更换不但节约了乙醇，更重要的是如果脱水剂全部更换为新液就会产生过脱水，组织发脆。经过几次脱水后的乙醇，浓度虽然只降低了5％～10％，但脱水过程中置换出的细胞外液、组织液等可减弱乙醇的脱水能力。因此实际工作过程中须根据组织块的多少、脱水剂的使用时间合理设定脱水剂的脱水时间、P／V循环和混合循环功能。

  (3)透明剂二甲苯10～15天更换一次。第一缸二甲苯倒弃，第二缸前移至第一缸，第二缸更换为新液。二甲苯起媒介作用，将无水乙醇置换出又使石蜡很好地浸入组织内。如果透明时间过长、强度过大(如P／V循环和混合循环全程使用)就会产生透明，以致组织发脆发干不利于切片。所以透明剂设定的时间、P／V循环和混合循环的使用要有机配合。

  (4)所用石蜡要干净无杂质，熔点58～60℃。使用一定时间后，倒弃二甲苯含量过高的第一缸石蜡，将后三缸石蜡依次前移，最后一缸换新鲜石蜡。石蜡温度设定为60℃，这样的温度可避免小标本浸蜡因温度过高而发脆。

  (5)脱水机要放置干燥通风房间，防止阳光直射显示屏。最好配置一台不间断电源(UPS)，防止瞬间断电影响机器使用。

  (6)使用全自动密闭式脱水机要防止过脱水，过透明。

  第五章 包埋

  一、意义

  组织块经过固定、脱水、透明、浸蜡等处理后，用包埋剂(如石蜡、树脂、塑料等)将其包制成含组织块的蜡块或塑料块等的过程称为包埋。不同的包埋方法有不同的要求，经包埋后，组织可达到一定的硬度和韧度，有利于切成理想的薄片。

  二、包埋步骤

  先将熔化的石蜡注入包埋托内(模具)，而后用镊子将经过浸蜡的组织块从脱水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷台上，用镊子轻按组织块，以达到组织块平整，盖上脱水盒底，再加好石蜡，移至冷冻台上，待冷冻好后，卸下组织蜡块待切。包埋时应根据组织的不同，选择大小型号适合的包埋托；有要求直立包埋的组织要用镊子将组织固定在蜡块中央稍停片刻，以使组织在蜡凝时立住，达到立埋的要求。

  三、注意事项

• 1．每次夹取组织块时，镊子用乙醇灯加热至温度适中。

  2．包埋托内不要有水、碎蜡等异物，以免影响包埋质量。

  3．包埋蜡的温度要控制好，包埋蜡的熔点应为58~60℃。

  4．包埋蜡加入少量蜂蜡(蜜蜡)，可以增加韧度，利于切片。

  5．夹取组织块放人包埋托内时，一定要注意包埋面。

  6．包埋好的蜡块，用刀修整时，一定要适当保留蜡块中组织周边的白蜡边，以利于连续切片。

  7．每包埋完一块组织，镊子必须擦干净或用乙醇灯烧。

  四、自动包埋机简介

  自动包埋机是对组织经脱水、浸蜡后进行包埋处理的设备。有多种类型，其设计具有人性化，一般整机由包埋部分和冷冻部分组合而成(一体化简洁紧凑)，全自动程序控制，具有延时自动开机功能，加热快速，温控准确，安全可靠，包埋效果好等特点，冷台最低温度可达一5℃，可进行快速冷冻处理包埋块，具有大冷台，冷冻面积大，可放置超大包埋盒或多个包埋盒。包埋部分温度可以从55～70℃，可储存3～5 L石蜡，自动熔解石蜡，可容纳70～100个样品包埋盒。金属板表面容易清洗，有2个加热的抽屉，可收集多余的石蜡，进行重新利用，避免石蜡浪费。具有冷却镊子架，方便使用。可配放大镜利于小活检标本的包埋；可配脚踏：石蜡注入由脚踏开关控制或上手工控制。所有温度和工作时间参数全部由程序控制，记忆功能配有备用电池，这使病理组织学实验室的工作更为灵活。这种独特的结合使当前组织学和病理组织学实验包埋技术达到了新的水平。是创新发展的石蜡包埋技术和智能化高水准工艺的完美结合。

  第六章 组织石蜡切片

  组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程为石蜡切片法。石蜡切片法现使用的切片机有平推式切片机、轮转式切片机两种。

  一、平推式切片机石蜡切片法

  1．切片前的准备：清洗过的载物片(或免清洗的)，毛笔，铅笔，小竹片，水槽，雾化器，摊片器，切片刀，刀架。

  2．切片制作步骤：刀架的粗削部放在头端，在切片机刀架部夹紧。组织蜡块装在切片机蜡块固定器上夹紧。右手握切片机刀头运动手柄，左手转动切片机蜡块运动旋钮。先转动此钮，后平拉刀架运动手柄，进行粗削，直至组织切全。停止，将刀架移到细削部，轻轻转动蜡块运动旋钮，后拉刀架手柄进行细削。削至组织光滑发亮，右手拿毛笔扫净刀架及蜡块上的蜡屑，组织屑，放下毛笔，再用右手握住刀架运动手柄。左手拿小竹片，用竹片头蘸一下水槽中的水。左手中指搬动薄切钮，雾化器的喷头对准蜡块。右手拉刀架运动手柄。左手中的小竹片在蜡块空白处等待切片刀切起蜡片一端挑起粘住，随切片刀移动，完整的蜡片切出后，粘在竹片上，移入水槽中，捞片，放在摊片器上摊片5 min后，装在染色篮上，放入75℃烤箱烤片。

  3．注意事项

  (1)无冷台的病理科可以将包埋好的组织蜡块放到冰箱内，但如放置时间过久温度太低切片时蜡块会产生热涨，切片会厚，要多切几张，后面的片子就会薄一些。

  (2)雾化器是去除静电的，但也有增加切片厚度的缺陷。尤其雾气大时，使蜡块热涨，厚度增加更明显。为了保证切片厚度，一定要控制好风力、雾力。雾化器使用自来水，水位控制在30刻度。

  (3)切片机使用前一定要检查各部位情况。先检查固定器是否固定在你所要的厚度上。切片机刀架角度与蜡块呈90。。从蜡块右上角进刀。

  二、轮转式切片机石蜡切片法

  1．切片前的准备：清洗过的载玻片、毛笔、铅笔、盛有30％乙醇的小烧杯、牙科镊、展片槽、切片机、一次性刀片及刀架。检查轮转式切片机切片厚度的钮是否固定于你所要切的厚度刻度上。

  2．切片制作步骤：将放在－5℃冷台上的组织蜡块装在切片机固定器上夹紧，空白蜡多的一端在上。将切片刀固定一端为粗削部，左手旋动蜡块推动器，右手旋动切片机把手。先摇动蜡块推动器，后摇动切片机机头半轮上下运动，进行粗削，一进一削，直至组织切全。而后将切片刀移至另一端进行细削，削至蜡块光滑平整。用毛笔将其刀架、蜡块面清扫干净。左手持毛笔，右手整轮转动切片机手柄进行切片。将毛笔贴于刀架背不时转动，轻轻托起连片的蜡片。右手停止转动机头，换持牙科镊，夹住连片蜡片头端，放入盛30％乙醇的烧杯内。用牙科镊去除不好的蜡片。放入水温45～50℃水槽内展片后捞片。

  3．注意事项

  (1)无冷台的病理科可以将包埋好的组织蜡块放到冰箱内，但如放置时间久温度太低注意切片时蜡块会产生热涨，切片会厚，要多切几张，后面的片子就会薄一些。

  (2)为了能够连片，蜡块两端要有空白蜡。多的一端放在上面。

  (3)展片槽温度不要过高，有时会有小组织块散漂在水面上造成污染。可用手纸折成与水槽宽度相同水面行走，将组织屑捞走。

  第七章 常规染色

  苏木精(hematoxylin)和伊(eosin)染色方法，简称HE染色方法，是生物学、细胞学与组织学最广泛应用的染色方法。在病理科称为常规染色方法。病理学的诊断都是以HE方法为基础的。染色的目的是把组织切片或细胞涂片等浸入染料及其他染色剂配成的染色液中，经过适当的时间和处理，使组织或细胞及其他成分染上不同深浅的颜色，产生不同的折射率，从而便于光学显微镜下进行观察和研究。

  进行染色前进行染色液的配制，应根据工作量的多少配制相应量的染液，同时应注意溶液种类的选择、溶液浓度、pH值等，另外也应注意配方的合理选择。在实际工作中，应做到以下几点。

• (1)保持染液的清洁，应经常过滤或更换。

  (2)染色时间应根据组织的种类、染液的新旧及特殊要求而决定。

  (3)染色环境温度对染色效果也有着密切的影响，故染色时间必须依据不同条件灵活掌握。

  (4)脱蜡干净与否对染色效果有着重要影响，烤片温度、脱蜡二甲苯的温度、二甲苯的新旧和二甲苯脱蜡的时间长短都与染色有着密切关联。

  (5)标本脱水的好坏及固定的充足与否对染色效果影响极大。

  (6)切片染色后，经梯度乙醇脱水，若每步的时间不足易造成切片发雾、模糊不清，影响诊断。

  在染色过程中，既要按常规方法步骤进行操作，也应根据实际情况、个人经验灵活运用，不断总结，才能熟练掌握并提高实际工作能力与效率。

  一、人工染色

  人工染色已使用近百年，至今还在使用，既古老又实用。人工染色的设置因地区的差异设置也不同，但大多数的地方基本一样。

  １．石蜡切片HE人工染色程序(见表8．1)。

2．注意事项

• (1)石蜡切片放入恒温箱中烤片，温度不可过低或过高，以75℃为宜，否则在染色过程中容易发生脱片。

  (2)组织切片脱蜡要经二甲苯三次才能彻底。切片从恒温箱取出后应趁热浸入二甲苯以利于彻底脱蜡。使用一段时间后，第一缸二甲苯融的蜡较多应倒弃，其后的二甲苯依次前移，最后一缸换新鲜的二甲苯。

  (3)切片经70％乙醇后入苏木精染液前，必须自来水水洗3次，最后1次最好用蒸馏水水洗并控干。这样可以保证Harris苏木精染色能力持久，而不会因为低浓度乙醇的混合而过早的丧失染色能力。

  (4)Harris苏木精染液配制的好坏直接影响切片染色质量。好的苏木精染液500 ml正常染色能力为2500张左右。为保证染色质量应及时更换染液。

  (5)苏木精染液要经常过滤以保证染色清洁而不在切片上有染色渣的出现。

  (6)盐酸乙醇分化液配制参见本书第十二章。分化时间可根据分化液的新旧适当调整，新的分化液时间短些。分化的目的就是让该染上要清晰地染上，而不该着色的一定要分化掉。

  (7)氨水返蓝液浓度不可过高，返蓝时间不可过高，不要过长，否则会发生脱片现象。

  (8)1％伊红水溶液是理想的胞浆染液。要选择好水溶性的伊红染料使胞质鲜艳一些，切片不但漂亮且利于观片。

  (9)切片染色后的脱水要充分，每道乙醇脱水的时间不要过短，尤其是三道无水乙醇更为如此。无水乙醇要勤更换。

  (10)切片经最后一次无水乙醇后尽快地放人二甲苯中。在夏季室内湿度较大的环境中更是如此。如切片在湿度大的空气中停留时间过长就会在封片时产生雾气，而不能现片。其原因是无水乙醇吸收了空气中的水汽，在二甲苯中难以分离析出，当用中性树胶封片后，二甲苯挥发，而水汽留在胶中产生雾气。

  (11)封片所使盖玻片需大小合适、清洁。树胶用量视盖玻片大小而定，要求不发生溢胶或缺如。

  (12)不提倡切片经无水乙醇，然后干燥，直接用中性树胶封固。这样会产生人为的细小黑点，与细胞核相似。

  (13)封片要在通风橱中进行，防止二甲苯污染工作间，危害技师的身体。

  二、自动染色机

  自动染色机是近几年才引进的病理自动仪器，在病理制片过程中发挥着重要的作用，它可以连续进行染色，自动记忆，染色效果好，质量控制到位。起到了手工无法比拟的作用。

  1．液体设置：由于机器为电脑控制，染液顺序及液体的设置根据染色机所设置的染色缸多少来调配。染色机基本模拟手工方法，利用机器手来完成操作程序见表8．2。

2．注意事项

• (1)工作前先检查染液及试剂，并开启电源。

  (2)开启进水开关。

  (3)调试好所需的染色程序，根据苏木精一伊红的新旧来调整时间。

  (4)将切片染色篮放人染色机后按提示键即可按程序进行染色。

  (5)听到提示音响后，取出已染好的切片染色篮进行封片。

  (6)工作完成后，关闭电源，关掉水源，并盖好染色缸。

  (7)染色机配制的无水乙醇及95％乙醇的程序比手工程序少，但不影响染色效果，因机械手在提升时有抖动作用，带的液体很少。

  (8)定期取出活性碳过滤网晾晒保证使用。

  (9)工作结束后一定要取出盐酸乙醇，以免长期放在机器内，腐蚀机器。

  第八章封片

  封片是将组织切片封固保存于载玻片与盖玻片之间，使之不与空气发生接触，防止其氧化、褪色，利于镜检观察及保存。

  一、手工封片

  手工封片应注意以下七点。

• (1)所用树胶浓度要适中，以一般速度滴下并恰能成珠既可。太稀时易溢出玻片，当二甲苯挥发后，组织切片就会收缩产生胶不匀并出现大片气泡。太浓时，滴在玻片上树胶不易散开，易产生气泡，难以驱除，并影响折光率。

  (2)树胶用量多少应根据组织大小、厚薄而定。

  (3)应迅速敏捷滴胶。

  (4)封片时，切片上应保留适当的二甲苯，以防干封，产生气泡。

  (5)为防止气泡，封片时，树胶不宜搅动。

  (6)如遇有小气泡时可用镊子轻压盖玻片，排除气泡。

  (7)封片时，若离面部较近，鼻、口呼出的气体会有水分造成切片云雾状甚至模糊不清，需引起注意。

  二、机器胶带封片机

  机器胶带封片机不用树胶，只用少量二甲苯即可封片。使用方便，切片诊断后即可归档，不会因树胶不干造成粘片等。使用封片机时，首先检查二甲苯瓶，并检查滴液分注量，检查胶带可用量、选择胶带长短规格，检查接片筐是否安装到位。工作时开通电源，并打开过滤网开关。工作完成后，关闭2个电源，擦拭机器。

  三、机器盖玻片封片机

  机器盖玻片封片机采用模拟人工手法来完成封片工作。使用机器封片，封片效率高、质量好，同时可减少封片对技术人员身体的伤害。其操作步骤为如下。

• (1)接通电源，打开开关，机器进行白检后，指示灯变绿即可工作。

  (2)将染色完成的染色篮准确的放人封片机内。

  (3)按动开始键，封片机进入工作状态。

  (4)封片结束后报警，即可取出封好的切片。

  机器盖玻片封片机的盖玻片采用24×40、24×50、24×60等规格的盖片(目前国产免洗盖玻片已代替进口，使用效果良好)。

  第九章冷冻切片的制作

  一、概述

  冷冻切片是利用物理降温的方法将新鲜的组织标本冷冻使其产生一定的硬度进行切片的技术方法。与石蜡切片相比，由于冷冻切片不需脱水包埋因此制片速度快，是为手术进行中的临床医师提供病理诊断的良好方法。此外由于冷冻切片的标本是未经固定的新鲜组织，因此冷冻切片也是脂肪染色、酶组织化学染色以及某些免疫组织化学染色和原位分子杂交的理想制片方法。冷冻切片的不足是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。

  二、冷冻切片的制作方法

  利用氯乙烷喷洒、二氧化碳喷射、半导体制冷的方法均可制作普通的冷冻切片，用于术中的病理诊断。恒冷箱冷冻切片机可以制作适用于各种目地的冷冻切片，是目前最为常用的理想冷冻切片制片方式。

  1.冷冻切片的技术操作方法

• (1)将恒冷箱冷冻切片机的速冻头和箱内温度调整到适宜的切温度，一般情况下为一18～一25℃。

  (2)在标本冷冻托上涂布一层冷冻包埋剂一OCT，然后将取材后新鲜标本安放在标本冷冻托上并用OCT覆盖标本。

  (3)标本冷冻完成后将标本托固定在切片机的机头上，调整机头位置使其恰好位于切片刀的后方。

  (4)使用粗切削方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平面，使用自动推进方式连续切削2～3刀后用毛笔清除机头、标本托及切片刀上的组织碎屑。

  (5)调整并确认切片的厚度，一般为4～8 um，染脂肪和神经组织应控制在12~25 um。

  (6)放下防卷板使防卷板的位置恰好与切片刀的刀刃完全平行并略突出于刀刃。

  (7)以自动推进的方式进行切片，良好的切片将在防卷板的下方形成一张完整平整的薄片，如切片略有弯曲可用小毛笔轻轻展平切片。

  (8)打开防卷板，用载玻片平稳地轻压切片使其平整地吸附到载玻片上。

  三、冷冻切片的染色

  切好的冷冻切片立即投入丙酮中进行固定，一般固定1～2 min即可进行染色，用于免疫组化染色的冷冻切片应在切片略干时即刻投入冷甲醇中固定10~15 rmin然后进行相应的组织化学染色程序。

  1．冷冻切片的HE染色程序。

• (1)切片在丙酮中固定1～2 min。

  (2)水洗5 s。

  (3)使用新鲜的Harris苏木精染液染细胞核2min。

  (4)水洗5 s。

  (5)在0.5％的盐酸乙醇液中分化1～3 s。

  (6)水洗5 s。

  (7)在0.5％～1％的伊红染液中染细胞质20~30 s。

  (8)水洗5 s。

  (9)在95％乙醇I、95％乙醇Ⅱ、100％乙醇I、100％乙醇Ⅱ、中逐级脱水各3～5 s。

  (10)甲苯I、二甲苯Ⅱ透明各5 s。

  (11)干组织周围的二甲苯，在二甲苯尚未干燥前滴加光学树脂胶封片。

  四、注意事项

  1．提倡使用新鲜苏木精染色液：高质量的冷冻切片和良好的染色，是病理医师为在手术中的外科医师提供病理诊断的重要手段。为了在短时间内获得高质量的HE染色冷冻切片，在保证高质量冷冻切片的同时使用新鲜的苏木精染色液是保证高质量染色的重要前提。

  2.防卷板的调整：正确地调整使用冷冻切片机的防卷曲板是获得平展完整冷冻切片的重要手段，防卷曲板的正确位置是与切片刀

  的刀刃平行并略微突出于刀刃。如防卷曲板过度突出于刀刃会造成切片机头上的组织与防卷曲板相撞，如防卷曲板低于刀刃会造成切片向上卷曲不能形成平整的切片。在调试时可从下向上逐步提高防卷曲板的位置，每提高一点切一张切片测试，直至切片能在防卷曲板下形成完整平展的切片。

  正确位置 防卷曲板低于刀刃 防卷曲板过于突出

  

  3.防止污染：切片污染是病理组织制片的大忌，在冷冻切片进行粗切削完毕后必须用毛笔清理碎屑，以防止其他标本的组织碎片沾染到正在进行切片的标本上。

  4．不同组织的切片温度调整：不同组织冷冻切片的冷冻温度调整原则是，柔软稚嫩富含水分的组织选择相对较高的温度，较为致密富含脂肪的组织选择相对较低的温度。柔软稚嫩富含水分的组织选择较低的温度易造成切片呈碎屑状，而致密富含脂肪的组织选择较高的温度易造成切片堆积不能形成片状。详见表9·1。

第十章常用特殊染色

一、六胺银染色

1．第一步准备工作：配制六胺银染液，将10％硝酸银2．5ml倒入干净的染色缸内，加入2％硼砂5ml，液体呈乳白色，再加入3％乌洛托品40ml，染液逐渐呈透明状。

2．第二步染色过程：事先把温箱调至60℃备用，切片经脱蜡至水，用1％过碘酸氧化10 min，水洗，然后切片放人六胺银染液放置60℃温箱1 h，染真菌时间要相对短一些，一般情况下肉眼看到染液变色，切片呈棕色时从温箱取出染色缸，倒掉染液，自来水冲洗1min，用0．25％氯化金调色1 min，水洗后，用3％硫代硫酸钠染5min,水洗，用苏木精染液浅染，水洗、分化、冲水返蓝，伊红染10 s，最后经脱水、透明、封固。

3．图示结果：基底膜与毛细血管间质性物质、真菌呈棕黑色，核呈蓝色。

4．注葸事项

(1)掌握染色温度和时间，如60℃染1 h，80℃染30～40 min。

(2)真菌类染色时间相对要短，染色时间过长，切片染色过深，可用分色剂处理。

二、黏液卡红染色

1．第一步准备工作：配制黏卡染液，将称好的胭脂1 g、氢氧化铝1 g倒入瓶内，加入50％L醇100 rnl混合摇匀，再加入氯化铝0．5g，水浴加温逐渐煮沸并搅动液体，使其充分溶解(注意染液容易外溅)，数分钟后，染液由红色变成透明深紫红色，冷却后将液体倒入量筒，再加入50％乙醇至原量，过滤，放人冰箱备用。

2．第二步染色方法：染液使用时原液与蒸馏水比例为1：4稀释.切片厚5 um，脱蜡至水，经苏木精染色2 min、水洗、分化、返蓝后进人黏卡液染色2 h以上，染液可以重复使用多次，但要适当延长染色时间．切片水洗后，脱水、透明、封固。

3．图示结果：黏液为红色，胞核为蓝色．

4．注意事项

(1)染液使用时比例为1份黏卡原液，4份蒸馏水。

(2)用酶消化对照染色特异性很大，消化时间为20 min。

(3)配制黏卡染液时要防止液体溅出。

三、石碳酸品红染色

1．第一步准备工作

(1)配制盐基性品红饱和液：盐基性品红溶于乙醇内。

(2)配制石碳酸水溶液：将石碳酸结晶放入热水浴溶解后取5 ml与事先预热的蒸馏水95ml匀备用．(以上二种液体可单独保存)。

(3)石碳酸品红染液：取盐基性品红溶液10 ml与5％石碳酸水溶液90 ml混合，使用前过滤。

2．第二步染色方法

切片厚度为6 um，脱蜡至水，石碳酸品红染色30 min至1 h，(或用微波炉高档加热10~20 s)，水洗，用1％盐酸乙醇分化洗掉切片上多余染液，水洗，0.1％美蓝浅染，背景为淡蓝色、冲水、晾干、封固。

3．图示结果：抗酸杆菌呈亮红色，背景呈淡蓝色。

4．注意事项

(1)用微波染色时切片容易脱落．

(2)美蓝染色宜浅。

四、奥辛蓝一PAS染色

1．第一步准备工作

(1)配制奥辛蓝染液；将奥辛蓝1 g溶解于3％的醋酸溶液，调整液体PH值为2.5。

(2)配制PAS染液：将碱性品红1 g加人煮沸的蒸馏水内溶解，温度降至50℃时加入亚硫酰氯1 ml(加亚硫酰氯时要在通风厨内进行)放入冰箱过夜。加入活性碳2 g，摇动混合液1 min，静止10 min后，过滤于棕色瓶内，放置冰箱保存。

2．第二步染色方法

(1)奥辛蓝染色：切片脱蜡至水经3％醋酸溶液l10min，切片直接进入1％的奥辛蓝染色10 min，水洗，必要时用1％的中性红对比染色，水洗。

(2)PAS染色切片厚5um，脱蜡至水，用0.5％过碘酸氧化10min后流水冲洗1 min，用纸吸干切片周围水分，用干燥的吸管吸取PAS染液，滴染10~20 min，流水冲洗1 min，用苏木精浅染1 min，水洗、分化、返蓝、然后进行脱水、透明、封固。

3．图示结果：PAS阳性物质呈玫瑰红色，胞核呈蓝色。

4．注意事项

• (1)加亚硫酰氯时要在通风厨内进行。

  (2)过碘酸恢复室温才能使用(20℃以内)。

  (3)染色时要加对照片。

  (4)氧化时间要限制在10 min内。

  (5)PAS染液易挥发使染色反应迟缓或红色太浅，加入数滴亚硫酰氯即可。

  (6)如果染奥辛蓝-PAS时，省略染苏木精步骤。

  第十一章常用试剂及染液的配制

  一、Harris氏苏木精染色液的配制

  1．试剂准备：苏木精10 g，硫酸铝钾80 g，无水乙醇200 ml，蒸馏水2000 rnl，氧化汞3 g，冰乙酸40ml。

  2．配制步骤

• (1)将2000 ml蒸馏水注入一只3000 的大号三角烧瓶内，加入80 g硫酸铝钾后置电炉或电磁炉上加热硫酸铝钾完全溶解。

  (2)将200 ml无水乙醇注入一只300 ml的三角烧瓶内，加入10 g苏木精摇动使之完全溶解。

  (3)将已完全溶解于无水乙醇的苏木色精液体缓缓注入已完全溶解的2000 ml硫酸铝钾液体中，继续加热至液体沸腾关闭电源。此时液体应呈透明的玫瑰红色。

  (4)将3 g氧化汞溶于20ml蒸馏水中搅匀后缓缓(一定要缓慢)方入未被氧化的苏木精液体中，边加氧化汞边搅拌。此时苏木精被氧化，液体的颜色会迅速地变成深蓝紫色。

  (5)氧化汞加完后用玻棒充分的搅拌液体并继续加热至液体再度沸腾关闭电源。

  (6)用湿毛巾保护，将装有停止沸腾的热苏木精的三角烧瓶转移至冷水中迅速降温至室温。

  (7)密封瓶口室温避光直射储存备用，临用前每100 ml苏木精液加入2～3 ml冰乙酸混匀。

  

  二、伊红染色液的配制

  l. 试剂准备；伊红Y 20 g，蒸馏水1500 ml，95％乙醇500 ml，冰乙酸lml。

  2．配制步骤

  (1)先将20 g伊红Y溶于500 m1蒸馏水中，用玻棒搅拌至其完全溶解后再加入1000 ml蒸馏水并搅匀，液体呈深红色。

  (2)加入500 ml 95％乙醇并搅匀，此时液体由深红色转变为荧光绿色。

  (3)加入lml冰乙酸并搅匀，密封瓶口室温储存备用。

  三、HE染色分化液的配制

  0.5％盐酸乙醇液：蒸馏水300 ml与95％乙醇700 ml混合后加入浓盐酸5 ml混匀。

  四、HE染色返蓝液的配制

  0.5％氢氧化氨液：在1000毫拜蒸馏水中溶入5毫升浓氢氧化氨混匀